香猪是一种原始袖珍猪种，经济早熟，肉嫩味鲜，皮薄骨细，是加工高等猪肉产物的优质原料；香猪耐粗饲，抗病力强，对表象变化具有较强的适合性，是抗病育种的细密素材；袖珍猪的生理值与东说念主类一样90后性交网，是一种理思的实验动物。毛色四肢香猪进军的表型特征之一，它在笃定品种纯度、亲缘关系和杂交组合以及评价产物性量等方面均有很强的参考价值。跟着猪杂种上风的庸俗应用，为使商品猪具有理思的毛色，亲本的毛色也成为一个需要精良研究的性状[1]。因此，揭示猪毛色的遗传机制偏激影响毛色的关联基因的遗传限定，关于猪的育种具有进军意旨。

猪毛色的酿成机制较复杂，是由一系列与玄色素的酿成与种类臆想的生理、生化反馈决定的[2-6]。动物体内的玄色素主要有两种：真黑素和褐黑素，真黑素主要酿成黑、褐两种毛色，褐黑素主要酿成红色和黄色的毛发[7]。哺乳动物的毛色是由多个基因决定的，这些基因影响着玄色素的生成或黑素细胞的生成、增殖和迁徙，如MC1R、TYR眷属(TYR、TYRP1、TYRP2)、KIT和MITF等基因不错调度玄色素的千里积而决定动物毛发的情愫。玄色素细胞又称黑素细胞(melanocyte cell， MC)，是合成玄色素的细胞，发祥于胚胎神经嵴细胞，主要散布于哺乳动物皮肤(表皮基底层)、毛发基质、黏膜和核心神经系统(软脑膜)、眼睛(视网膜色素上皮、葡萄膜束)、耳朵(血管纹)中[8]。玄色素生成是一种酶的级联调控，由酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)、酪氨酸关联卵白酶1(tyrosinase-related protein 1，TYRP1)和酪氨酸酶关联卵白2(tyrosinase-related protein 2，TYRP2)共同调控[9]。TYRP1是玄色素生成进程中的重要酶，哺乳动物皮肤色素的千里着进度取决于它的催化活性[10-11]。Dell′angelica[12]研究发现，TYRP1基因在东说念主玄色皮肤黑素细胞中的抒发明显高于白色皮肤。Manga等[13]发现， TYRP1基因突变会引起南非东说念主种产生白化病。Cargill等[14]研究标明，TYRP1基因可能与犬白色背部皮肤上的玄色和褐色黑点的酿成臆想。覃海等[15]发现， TYRP1基因在剑白香猪玄色被毛皮肤中的抒发量显贵高于白色被毛皮肤。TYRP1是影响玄色素生成的进军候选基因之一，通过对玄色素生成关联基因的抒发调控以及在体内抒发产物间互相作用从而调控玄色素的生成。

本研究以香猪表皮黑素细胞为模子，探究敲降TYRP1基因后对香猪表皮黑素细胞TYR基因眷属mRNA和卵白抒发及玄色素生成的影响，为研究猪玄色素生成调控机制和毛色关联性状的选育提供臆想表面依据。

试验动物为贵州大学香猪育种场的3月龄健康香猪3头，具有头部和尾部为玄色、其他部位均为白色被毛的“两端乌”外貌特征。用耳钳和钻孔器分别相聚香猪耳朵和背部的皮肤组织，使用75%酒精消毒后，用含双抗的PBS冲洗3次后放入含双抗的DMEM培养基中并置于冰盒，在2 h内带回实验室进行后续处罚。

酒精、二甲苯、石蜡、4%多聚甲醛(天津市科密洋化学试剂有限公司)、苏木素-伊红染色试剂盒(北京中杉金桥生物时候有限公司)、胎牛血清(FBS)、DMEM培养基(Gibco)、MelM培养基(ScienCell)、0.25% 胰卵白酶-EDTA(Gibco)、青链霉素搀杂液(Solarbio)、DispaseⅡ(Gibco)、磷酸盐缓冲液(PBS)、多巴(L-Dopa，Sigma)、逆转录试剂盒(CWBIO)、荧光定量试剂(MagicSYBR Mixture，CWBIO)、2×Taq MasterMix(CWBIO)、LipofectamineTM 2000转染试剂盒(Invitrogen)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(CWBIO)、PVDF膜、脱脂奶粉、Tween-20(博士德)、卵白彩虹Maker(Thermo)、甲醇、兔抗多克隆一抗：TYR、TYRP1、TYRP2和MITF (Abcam)，兔抗β-actin多克隆一抗(Abcam)，山羊抗兔二抗(Abcam)等均购自卓一世物时候有限公司。超高速台式冷冻离情绪(Thermo SL40)购自德国Thermo Electron公司，PCR扩增仪(C1000 TouchTM)、及时荧光定量PCR仪(Bio Sens SC710)购自好意思国BIO-RAD公司， CO2细胞培养箱(SERIES Ⅱ WATER JACKET)购自好意思国Thermo Scientific公司， 格外荧结拜微镜(Nikon C-SHG1)购自日本NIKON尼康公司， 酶标仪(Synergy Mx)购自好意思国伯腾公司， 超净责任台(SW-CG-1F)购自苏州净化成立有限公司。

1.3.1 皮肤组织苏木素-伊红(HE)染色 　　将相聚的皮肤组织放入4%多聚甲醛溶液中过夜固定，用剖解刀修成0.5 cm×0.5 cm的正方形进行脱水、透明。将皮肤组织包埋后修整蜡块，用切片机从蜡块上切下稳当长度的蜡带并展片，用载玻片将蜡片捞起置于烘箱中65 ℃烘烤过夜。HE染色前对片子进行脱蜡水化，按照苏木素-伊红(HE)染色试剂盒发挥书进行染色。终末用中性树脂进行封片，天然风干后用二甲苯将玻片上充足残留的中性树脂擦掉，再次风干后在显微镜下不雅察。

1.3.2 香猪表皮黑素细胞培养 　　在超净台顶用剪刀将耳组织充足毛发剪掉，去掉皮下脂肪，用75%酒精和含1%双抗的PBS轮流清洗3次。将清洗好的皮肤剪小至2 mm×5 mm，放入盛有0.15%Dispase Ⅱ酶消化液的离心管中，使消化液没过皮肤组织，37 ℃培养箱中消化2~4 h，时间更换消化液一次。在超净责任台内取出新的培养皿，加入含双抗的PBS溶液，程序洗涤皮肤组织，然后用镊子轻轻将表皮与真皮分离，网罗并剪碎表皮并放入15 mL离心管，加入0.25%胰卵白酶-EDTA消化液使其没过皮肤组织，置37 ℃水浴锅中消化8~12 min，用格外荧结拜微镜不雅察细胞消化情况。在消化液中赶快加入等量的含10%胎牛血清的培养基断绝消化，200目筛网过滤后400目筛网再次过滤，然后将滤液转换至15 mL离心管中，4 ℃ 1 000 r ·min-1离心10 min。弃上清液，取适量MelM培养基(含1%黑素细胞孕育因子、10%胎牛血清、1%双抗)加入离心管中，奏乐混匀后酿成细胞悬液。将细胞悬液放入培养瓶中，置37 ℃、含5% CO2培养箱中培养，72 h首次换液，之后每2~3 d换液1次，传至4~5代时可赢得较纯的黑素细胞。

1.3.3 香猪表皮黑素细胞孕育弧线的测定 　　取处于对数孕育期的第4代香猪表皮黑素细胞，将细胞浓度调整为4×104个·mL-1后按200 μL每孔接种于96孔板，置37 ℃、含5% CO2培养箱中培养。24 h后，逐日在96孔板上随即收用3个孔作念MTT比色试验，共10 d，剩余细胞每2 d换液1次。作念MTT比色试验时每个待测孔加入20 μL浓度为0.5%的MTT，培养4 h后吸弃液体，每孔加入100 μL DMSO，置于37 ℃细胞培养箱中孵育30 min，待细胞内结晶充分融化后，在自动酶标仪490 nm波长下测得吸光度(OD)。以时间(d)为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞孕育弧线。

1.3.4.1 L-Dopa染色　　取交融度达80%的第4代黑素细胞，弃去培养瓶华夏有培养基，PBS清洗细胞3次后使用4%多聚甲醛固定30 min。固定完成后弃去固定液，PBS清洗3次，使用0.3% TritonX-100对细胞进行通透30 min。PBS对细胞冲洗3次后使用0.1% L-Dopa染色液对细胞进行染色，放入37 ℃培养箱孵育，2 h时更换染液，接着再孵育2 h。染色终了后PBS冲洗细胞，显微镜不雅察，细胞胞浆内不雅察到玄色或棕色的色素颗粒，发挥该细胞为黑素细胞。

1.3.4.2 及时荧光定量PCR果决　　黑素细胞内有特异基因抒发，如：TYR、TYRP1、TYRP2、MITF、KIT等，期骗及时荧光定量PCR时候检测细胞中毛色关联基因的抒发水平，以此来果决黑素细胞。取交融度达80%的第4代细胞，利用Trizol试剂盒提真金不怕火细胞总RNA，并回转录cDNA。以RPS18四肢内参基因，凭证好意思国国立生物时候信息中心(NCBI)GenBank中公布的野猪(Sus scrofa)序列，用Premier 5.0软件遐想引物，引物由北京擎科生物时候有限公司合成，序列见表 1。

1.3.4.3 Western Blot果决　　检测细胞中毛色关联卵白TYR、TYRP1、TYRP2和MITF的抒发水平，以此来果决黑素细胞。将交融度达80%的第4代黑素细胞用PBS洗涤3次后使用卵白裂解液分离提真金不怕火香猪黑素细胞的总卵白，并使用BCA法检测卵白浓度，调整卵白浓度后100 ℃水浴锅中水浴3 min使卵白变性。按照SDS-PAGE凝胶试剂盒操作发挥配胶，电泳使卵白分离，每构成就3个调换。按照卵白Marker发挥切下含野心卵白的胶条，将磋商卵白转换到PVDF膜上后使用含5%脱脂奶粉的TBST阻滞3 h，然后与兔抗TYR、TYRP1、TYRP2和MITF及内参兔抗β-actin在4 ℃垂直摇床上孵育过夜。用TBST洗涤3次后，将膜与HRP象征的山羊抗兔抗体在37 ℃下孵育2 h。领受均匀涂抹超敏ELC发光液，相聚图像后胶片曝光。

1.3.5 小搅扰RNA(siRNA-TYRP1)的合成 　　凭证香猪TYRP1基因(GenBank No.: 537161)全序列，由上海吉玛生物科技有限公司合成5个siRNA序列，如表 2所示。

1.3.6 细胞转染 　　将培养瓶内的黑素细胞用胰酶消化后铺至细胞6孔板中继续培养，待细胞贴壁后更换培养基。在格外荧结拜微镜下不雅察细胞，待细胞孕育密度达80%时开动进行转染，将5种小搅扰RNA和一组对照组(NC)转染进细胞，每组处罚成就3个调换。按照转染试剂盒操作发挥进行转染。

1.3.7 及时荧光定量PCR检测毛色关联基因抒发 　　转染48 h后，用Trizol法提真金不怕火RNA并回转录为cDNA，期骗及时荧光定量PCR时候检测香猪玄色素细胞转染TYRP1-siRNA后TYR、TYRP1和TYRP2基因在mRNA抒发水平的变化。及时荧光定量PCR反馈的引物序列见表 1。

1.3.8 Western Blot检测毛色关联卵白抒发 　　转染48 h后提真金不怕火黑素细胞总卵白，调整卵白浓度并变性后进行Western Blot试验检测TYR、TYRP1和TYRP2的卵白抒发水平，内参采纳兔抗β-actin，每构成就3个调换。

1.3.9 黑素细胞中总玄色素含量的测定 　　转染48 h后，PBS吹洗并消化计数。细胞悬液4 ℃，12 000 r ·min-1离心10 min后弃上清，PBS清洗3次后再次离心，弃去PBS。在千里淀中加入300 μL的1 mol ·L-1 NaOH溶液，充分融化后，80 ℃金属浴裂解30 min。取融化后的样品，10 000 r ·min-1离心10 min，取上清，设3个调换，酶标仪475 nm波长下测其OD值，记载数据，分析筹备玄色素含量的变化。

通过2-ΔΔCt法对及时荧光定量PCR数据进行筹备分析。对赢得的磋商卵白图像利用Image J软件测定灰度值并进行半定量分析。Excel表格分析处罚数据，数据用“Means±SD”暗意，领受SPSS 19.0统计软件进行单要素方差分析考试。单独两样品之间利用t考试法检测各异显贵性；*.P < 0.05为各异显贵，**.P < 0.01为各异极显贵；样本调换数n=3，终末利用prism软件绘制。

对玄色和白色香猪皮肤进行横切和纵切，经过HE染色不雅察到香猪不同情愫被毛皮肤中黑素细胞的散布特征，并不雅察到完竣的毛囊结构。图 1显露， 黑素细胞主要散布在香猪玄色被毛皮肤中的毛囊外根鞘部位以及表皮，玄色素颗粒主要在皮肤表皮的下层、毛囊的毛干以及毛乳头部位千里积，香猪白色被毛皮肤组织中并未不雅察到玄色颗粒的千里积。

使用格外显微镜对细胞形状进行不雅察，原代培养2 h后，培养基中黑素细胞和角质酿成细胞交叉分散，少部分细胞开动贴壁(图 2A)；12 h后，基本贴壁实足，在角质酿成细胞中散在散布卵形、三角形或南北极树突状细胞(图 2B)；24 h后，大部分细胞胞体椭圆，含2个对称树突；少数细胞胞体呈多角形或不规则形，含2个或以上树突(图 2C)。培养约10 d后可首次传代，传至第4代时，可分离出密度较大较纯的香猪表皮黑素细胞(图 2D)。

由图 3可知，第4代黑素细胞孕育弧线呈“S”型，合乎细胞孕育限定。培养第1~3天时细胞增殖迟缓，处于躲避期；第4~8天大宗孕育，干涉对数孕育期；第8天后孕育开动减缓以致停滞，干涉平台期。

2.4.1 L-Dopa染色 　　第4代原代表皮黑素细胞多巴染色呈阳性，细胞质及细胞核被染成棕玄色，细胞质内可见玄色色素颗粒(图 4)。

2.4.2 香猪表皮黑素细胞标记基因的及时荧光定量PCR检测 　　对第4代香猪表皮黑素细胞进行TYR、TYRP1、TYRP2、MITF和KIT基因的及时荧光定量PCR检测，范围显露，第4代细胞中TYR、TYRP1、TYRP2、MITF和KIT基因均有抒发(图 5)。发挥香猪表皮黑素细胞系在第4代保抓着独有的基因和生物学活性。

2.4.3 Western Blot果决 　　对第4代香猪表皮黑素细胞中TYR、TYRP1、TYRP2和MITF的卵白抒发水平进行检测，范围显露，第4代细胞中TYR、TYRP1、TYRP2和MITF卵白均有抒发(图 6)。发挥香猪表皮黑素细胞系在第4代保抓着独有的卵白和生物学活性。

将TYRP1基因的5条siRNAs和对照组NC分别转染香猪黑素细胞，培养细胞48 h后进行搅扰效果检测。范围标明，TYRP1基因的mRNA抒发量较对照均显贵下跌(P < 0.01)，其中si-TYRP1-4搅扰效果最高，达到76.99%(P < 0.01)(图 7)。因此选拔si-TYRP1-4用于后续试验。

及时荧光定量PCR范围显露， 与NC转染组比较，si-TYRP1转染组中TYR、TYRP1、TYRP2基因的mRNA相对抒发水平均显贵下跌(P < 0.01， 图 8)。

Western Blot范围显露， 与NC转染组比较，si-TYRP1转染组中TYR、TYRP1、TYRP2卵白相对抒发水平均显贵裁减(P < 0.01， 图 9)。

玄色素含量测定范围显露，与NC转染组比较，si-TYRP1转染组的玄色素含量裁减了24.78%(P < 0.01， 图 10)。发挥敲降TYRP1基因可扼制玄色素的生成。

黑素细胞主要有3类，第一类散布在表皮中，很少增殖分化，主邀功能为生成玄色素拒抗紫外线的伤害；第二类是散布在毛囊中的黑素细胞，每个毛发孕育周期中齐会调换的增殖分化，不生成玄色素颗粒，主如果体内黑素细胞的开端；第三类是散布在毛球部位，这类黑素细胞不行增殖分化，关联词能产生大宗的玄色素颗粒，是由毛囊中的黑素细胞分化而来的[16]。高泽成等[17]研究发现，在牦牛皮肤中，玄色素颗粒主要散布在玄色被毛的毛干中，其次在毛乳头、毛囊外根鞘、皮肤表皮基底层也有散布，黑素细胞主要散布在皮肤表皮、毛囊与毛囊周围。谢光跃等[18]发现，在乌骨山羊中，玄色被毛毛囊外根鞘一周的玄色素细胞呈高度空泡状， 周围散布着大宗玄色素颗粒，和周围细胞分别明显；而白色被毛毛囊外根鞘部位的玄色素细胞树突不明显，与周围细胞很难以肉眼分别，周围莫得明显的玄色素颗粒。张建等[19]提到有色毛猪的毛根和毛囊中的老练黑素细胞中充满玄色素颗粒；而白毛猪的毛囊中莫得黑素细胞，且毛囊细胞较小。本研究范围显露， 黑素细胞主要散布在香猪玄色被毛皮肤中的毛囊外根鞘部位以及表皮。玄色素颗粒主要在皮肤表皮的下层，毛囊的毛干以及毛乳头部位千里积，而香猪白色被毛皮肤组织中并未不雅察到玄色颗粒的千里积。黑素细胞合成色素颗粒是动物毛色酿成的基础，玄色素的数目和种类决定了动物的毛色和肤色。本研究在参考前东说念主研究模范的基础上加以改造，使用DispaseⅡ和胰酶-EDTA两步法在体外告捷分离培养了香猪表皮黑素细胞，并对其孕育特质、特异基因及编码卵白抒发、多巴染色进行了不雅察，范围与前东说念主[20-22]对黑素细胞的果决范围一致，标明培养的黑素细胞保抓了庞大的生物学特质。为后续试验提供了细胞模子。

TYRP1是第一个克隆告捷的色素基因，在玄色素生物的酿成阶梯中起到了重要作用[23]。由于TYRP1基因编码卵白与酪氨酸酶同源，因而被称为酪氨酸酶关联卵白1[24]。此前有报说念称，TYRP1在内质网中充任TYR的伴侣，这加多了TYR的褂讪性，并标明这两种卵白质在黑素体内酿成二聚体[25-26]。TYRP1基因有二硫氧基吲哚酸氧化酶的功能，在黑素细胞合成玄色素的下贱阶梯中证实进军作用，并影响了黑素细胞的增殖凋一火、玄色素小体的老练、玄色素的超微结构、玄色素合成进程、玄色素瘤细胞的孕育、形状和TYR的活力等[27]。在玄色素合成进程中，TYRP1影响真玄色素与伪玄色素的窜改，高活性TYRP1导致真玄色素的产生，反之则产生伪玄色素[28-29]。到现在为止，TYRP1照旧在常见动物，如绵羊、小鼠、禽类、水产动物鱼类等多个物种中参与色素的千里积，但在猪上的研究则比较匮乏。Wu等[30]发现， 五指山猪玄色皮肤和白色皮肤中TYRP1的抒发存在各异。Ren等[31]发现， 凉山猪的金色表型与TYRP1的显性突变臆想；TYRP1基因中6 bp缺失导致中国脉土猪棕色表型[32]。

Small interfering RNA (siRNA)是一类长约21~25 bp的小RNA分子，大略引发与之互补的靶mRNA的千里默[33-34]。Li等[35]发现， 在体外敲降TYRP1能促进MHC1的抒发，并四肢诊疗玄色素瘤的一个潜在靶点。Gilot等[36]在体外敲降TYRP1后归附了miR-16的玄色素瘤扼制功能。为了发挥注解TYRP1与香猪玄色素生成臆想，本试验通过siRNA敲降，裁减TYRP1基因在香猪黑素细胞中的抒发，进一步研究了TYRP1与毛色关联基因抒发之间的关系。范围标明， 敲降TYRP1后会扼制玄色素生成关联基因TYR、TYRP1和TYRP2偏激编码卵白的抒发，从而扼制香猪表皮黑素细胞中玄色素的生成。TYRP1基因偏激编码卵白的抒发下调是由于TYRP1的平直敲降引起的，TYRP1抒发裁减会导致TYR和TYRP2的抒发裁减。天然TYRP1大略影响黑素细胞中玄色素的生成，但其调控机制还需进一步试验加以考证。

本研究通过HE染色不雅察香猪皮肤毛囊结构及黑素细胞的散布特征90后性交网，利用两步法体外分离培养香猪表皮黑素细胞并进行了果决，为香猪毛色基因功能研究提供细胞模子。范围标明，搅扰TYRP1后香猪表皮黑素细胞中TYR、TYRP1和TYRP2基因mRNA偏激编码卵白的抒发下调，况兼扼制了玄色素的生成。本研究范围为进一步探究TYRP1对玄色素生成及千里积的调控机制提供了试验参考和基础数据。

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